The visualization of the tumor vascularization using micro computed tomography

Abstract: Cancer has been one of the most serious diseases and according to the world health organization (WHO) the total number of deaths due to cancer (7.6 million worldwide) will globally increase in future to 13.1 million deaths. Tumor-growth is strongly related to the neo-formation of blood vessels (angiogenesis), since the vessels provide the cancerous tissue with the necessary nutrients and oxygen. For this reason in this study 3D high resolution visualization and parametrization of tumor vessels down to capillary size was carried out. 3D datasets were acquired using synchrotron radiation-based micro computed tomography (SRµCT) which provided sufficient spatial resolution to make also the smallest vessels down to 4 µm visible. The contrast in the image is defined by the degree of X-ray attenuation/absorption in the specimen. Because absorption coefficients did not differ signifficantly between different kinds of soft biological tissue, contrast enhancement of the specimens was needed to obtain sufficient contrast in the tomograms. Contrast enhancement was done either by blood vessel staining using a contrast agent (see Chapter 2) or by generating corrosion casts of the vessels (see Chapters 2 and 4). Alternatively, phase contrast based SRµCT was used which allowed the vessel tree visualization without any contrast enhancement (see Chapters 3 and 4). This technique measures the phase shift of the photon beam induced by a tumor. The sensitivity was shown to be 25 times higher in comparison to the absorption contrast based data. By staining the tumor vascularization as seen in Chapter 2, characteristics of the tumor vessel morphology could be revealed. According to the vessel shape and the vessel density it was possible to identify the interface between the tumor and the healthy tissue. Vessels in cancerous tissue appeared strongly twisted. Additionally, several regions were found in tumors where the contrast agent leaked out from the cancerous vessels presumably due to damages of the vessel walls within the cancerous tissue. Vessel-free regions could be observed which gave evidence of necrosis in the tumor. Most of the tumors exceeded the field of view, i.e. they do not fit the image of the camera, when using high resolution optics to reveal the smallest vessels in the 3D dataset. Local tomography of a tumor cast was carried out to allow high resolution imaging of a region of interest. Because of the interest in the morphology of the whole tumor the local tomography data was compared to the less resolution global SRµCT data. It was shown that the absorption coefficients in the locally acquired data differed signifficantly from the ones of the global datasets. These differences are caused most probably by the non-locality in the filtered backprojection calculation which is needed to generate tomograms out of the radiographs. These non-locality artifacts caused the absorption coefficients in the tomographic slices to shift to higher values for increasing distances of the pixels to the rotation center. For this reason this effect is also called 'cupping artifact'. Additionally the high resolution images were affected by edge enhancement due to the coherence of the X-ray beam which caused the peaks in the 1 mage histogram to appear more broadened. The correction method, de-cupping method, empirically post-corrected the cupping artifacts in the local tomograms using the global data as reference. In another correction method the origination of these artifacts was prevented by extending the local sinograms using the less detailed global ones. Mathematically a sinogram is the radon transform of a tomographic slice [1]. It can easily be constructed using the corresponding radiographs acquired at different rotation aFngles. While the sinogram extension method proved better correction of the total µ-shift (90%), the de-cupping method was more suitable to correct the histogram broadening (78%). By matching the global and local histograms in the projections the peak broadening caused by edge enhancement could be reduced by 41%. An alternative method to measure the blood vessels using SRµCT is based on the measurement of the X-Ray phase shift instead of the X-ray absorption when transmitting through the specimen. The quality of two such phase contrast based SRµCT methods (grating and propagation-based) was analyzed in Chapter 4, using the contrast-to-noise-ratio, the spatial resolution and the presence of artifacts. For the measured tumor tissue the holotomography technique provided better spatial resolution (SR = 8 µm) in comparison to the grating interferometry (SR = 24 µm). The contrast to noise ratio however is much better in grating interferometry (CNR = 57) than in holotomography (CNR = 11).for further studies the data obtained by holotomography was used, as it provided the visualization of the smallest vessels despite the reduced contrast. Together with the absorption contrast based vessel cast of healthy and cancerous tissue the tumor, measured with holotomography, were analyzed according to their vessel parameters. Skeletonization and vectorization of the voxel based data allowed an easier extraction of the characteristic parameters. The calculations revealed a mean vessel diameter of 8.8 ± 4.2 µm and a tortuosity value of 0.18 ± 0.19 rad for all vessels in the healthy corrosion cast. The cancerous vessels showed a mean diameter of 5.4 ± 5.5 µm and a mean tortuosity value of 0.24 ± 0.25 rad. While the value for the vessel diameter showed differences between healthy and cancerous tissue, the tortuosity was more or less equal for both tissues. The quantification of vessel trees using SRµCT data belongs to the vital steps in understanding of tumor formation and growth and in developing strategies against the disease. ---------- Zusammenfassung: Krebsleiden zählen zu den lebensbedrohlichsten Krankheiten der modernen Welt und lautAussage der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird die Anzahl von Krebserkrankungen auch in Zukunft weiter ansteigen. Um Fortschritte in der medizinischen Behandlung von Krebspatienten zu erzielen, ist die Erforschung des Tumorwachstums grundlegend. Die Expansion eines Geschwulstes wird duch die Angiogenese vorangetrieben, da die Bildung von neuen Blutgefässen die Versorgung des Krebsgewebes mit Sauerstoff und den nötigen Nährstoffen gewährleistet. Aus diesem Grund beschäftigt sich diese Arbeit mit der Visualisierung und Analyse von Blutgefässen in Tumoren. Zur 3-D-Darstellung der Blutgefässe wurde Mikro-Computertomographie an Synchrotronstrahlungsquellen (SRµCT) verwendet. Diese bildgebende Technik liefert hochaufgelöste Aufnahmen, die auch kleinste Blutgefässe mit einem Durchmesser von 4 µm sichtbar machen. Der Bildkontrast wird dabei durch die Absorption der Röntgenstrahlung in der Probe bestimmt. Bei Weichgewebe sind die Unterschiede in den Absorptionswerten jedoch zu gering, um die Blutgefässe vom umliegenden Gewebe zu unterscheiden. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit kontrastverstärkende Massnahmen durchgeführt. In Kapitel 2 wird beschrieben wie ausreichender Kontrast durch die Färbung der Gefässe mit Hilfe eines Kontrastmittels herbeigeführt wurde, so dass deren Morphologie erkennbar wurde. Die damit gewonnenen Daten machten es möglich, gesundes von krankem Gewebe zu unterscheiden. Erkranktes Gewebe zeigte in den CT-Bildern vermehrt spiralförmige Blutgeffässe und man konnte erkennen, dass das Färbungsmittel an einigen Stellen ausgelaufen sein musste. Dies lässt auf eine Nekrotisierung der Blutgeffässe schliessen, welche ausserdem zur Folge hatte, dass grosse Bereiche des Tumores überhaupt keine Blutgefässe vorwiesen. Da viele der untersuchten Tumore grösser als das durch den Detektor vorgegebene Sichtfeld waren, wurden sowohl lokale SRµCT-Messungen eines ausgewählten Bereiches als auch globale SRµCT-Messungen des gesamten Tumors, aber mit einer schwächeren Auflösung, durchgeführt (Kapitel 3). Um einen genügend hohen Kontrast zu erhalten, wurde für den Vergleich der globalen und lokalen Messungen ein Blutgefässabguss aus Polymer erstellt. Es stellte sich heraus, dass sich die Absorptionswerte in den lokalen Tomogrammen von denen in den globalen Tomogrammen unterschieden. Diese Unterschiede können auf die Nicht-Lokalität der gefilterten Rückprojektion zurückgeführt werden, ein Verfahren, das die Tomogramme aus den Projektionen errechnet. Diese verursachte eine ansteigende Verschiebung der Absorptionskoeffizienten zu grösseren Werten. Zusätzlich führte die Kohärenz der Strahlung bei der hohen Auflösung in den lokalen Bildern zu einer vermehrten Kantenverstärkung, so dass die Peaks in den Histogrammen breiter wurden. Da die Absorptionswerte in den globalen Tomogrammen den wahren Absorptionswerten der Probe am nächsten kommen, wurden die Werte in den lokalen Tomogrammen denen der globalen Tomogramme angepasst. Um 3 die Artefakte der nicht-Lokalität zu korrigieren, wurden diese zum einen empirisch bestimmt und aus den Bildern entfernt. In einer zweiten Methode wurde die Bildung dieser Artefakte umgangen, indem vor der Rekonstruktion die fehlenden Bereiche in den lokalen Projektionen durch die entsprechenden in den globalen Projektionen ersetzt wurden. Während die Artefakt-reduzierende Methode die grösstmögliche Korrektur der nicht-linearen Verschiebung der Absorptionskoeffizienten lieferte (78%), wurde die bestmögliche Korrektur der totalen Verschiebung mit Hilfe der Projektionserweiterungen zu 90% herbeigeführt. Die durch Kantenverst ärkung verbreiterten Peaks konnte man am besten korrigieren, indem man die Grauwertbereiche in den Histogrammen der Projektionen vor der Rekonstruktion aneinander anpasste (41%). Eine alternative Methode zur Bildgebung der Blutgefässe mit Hilfe von SRµCT basiert auf der Messung der durch die Probe verursachten Phasenverschiebung der Röntgenstrahlung. Da es verschiedene Methoden in der Phasenkontrast-basierten µCT gibt, wurden in Kapitel 4 die Qualitätsunterschiede zweier solcher Methoden (Gitterinterferometrie und Holotomographie) untersucht. Die Qualität wurde unter anderem anhand der räumlichen Auflösung und des Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisses definiert. Dabei lag die Gitterinterferometrie mit einem fünffach höheren Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis gegenüber der Holotomographie im Vorteil. Die Holotomographie ermöglicht im Gegensatz dazu eine dreimal bessere Auflösung. Obwohl diese Methode einen schwächeren Kontrast vorweist, wurde sie für weitergehende Studien verwendet, da sie die Möglichkeit bot auch die kleinsten Blutgefässe darstellten zu können. Zusammen mit den absorptionsbasierten Tomogrammen der Blutgefässabgüsse, sowohl von gesundem als auch krebskrankem Gewebe, wurden die Holotomographiedaten verwendet, um die Gefässparameter zu bestimmen. Dazu wurden die dreidimensionalen voxelbasierten Daten skelettiert und anschliessend vektorisiert, was die Auswertung erleichterte. Die Berechnungen für gesundes Gewebe ergaben einen mittleren Gefässdurchmesser von 8.8 ± 4.2 µm und ein Ausmass der Gefässwindungen von 0.18 ± 0.19 rad. Tumore zeigten dagegen einen Gefässdurchmesser von 5.4 ± 5.5
µm und eine Ausmass der Gefässwindungen von 0.24 ± 0.25 rad. Während dieWerte des Durchmessers sichtbare Unterschiede zwischen dem gesunden und dem kranken Gewebe aufweisen, sind bei dem Ausmass der Gefässwindungen im Rahmen der Messungen keine Unterschiede erkennbar. Die Parametrisierung der Blutgefässe mit Hilfe der SRµCT gehört zu den vielversprechenden Methoden um die Tumorbildung zu untersuchen.