Evaluierung zellulärer Marker zur Charakterisierung der Schutzleistung von Sonnenschutzprodukten

Summary: Great importance is attributed globally to the protection against UV radiation and the resulting short and/or long-term damaging effects on the human skin. Increasing skin-cancer rates demonstrate the urgency of a broad-spectrum protection of the skin against sunlight and an extensive information and behavioural training for the population. Unlike earlier formulations (between 1985 and 2000), current sunscreen products contain UV filter combinations, with broader protection in the UVB and UVA range of the solar spectrum. The efficacy of the products is expressed by the sun protection factor (SPF) (in vivo determination), which is a measure of the protection against the development of erythema. However, SPF only characterises the protective performance in the UVB range. Determination of SPF is performed exclusively on humans, is time-consuming and expensive and is accompanied by the damaging of the skin of volunteers. Additionally the link between erythema and the development of skin cancer is not completely understood. The UVA protection capacity of a sun protection product can also be determined and the compliance with all requested EU recommandations is indicated with the UVA logo. The UVA protection factor (UVA-PF) can be determined with an accepted in vitro method. There is a worldwide research for additional parameters for characterizing the protective performance of sunscreen products.
The objective of the present work was the development of an in vitro test system to characterize the protective performance of formulations already during the development phase. In this context, markers suitable for the characterization of UV-induced damage are evaluated at cellular levels. Different cellular localisations, such as extracellular matrix, cytoplasmic range and nucleic region should be considered in the selection of potential cell damage markers.
Cytokines (interleukin 1a and interleukin 8), p38-MAPK, p53, and cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) have been analysed experimentally as potential markers. Normal human keratinocytes (HNK) and immortalised HaCaT cells served as models and were exposed to UV radiation. Assay techniques such as ELISA and/or flow cytometry (FACS) were used for read-out evaluation.
The kinetics and dose-response relationships were determined for each marker in individual preliminary tests. Two of the five markers tested, delivered no reproducible results. The experiments performed with cytokines as potential cell damage markers were regarded as unsuitable due to the high divergence in the measurement values, and were not followed up.
In order to evaluate the selected test systems, different sunscreen products (SPF 5 to 50+) were analyzed. The products were applied to PMMA platelets and the latter were attached to the cell culture dishes. Following UV exposure the markers were quantified.
In the case of p38-MAPK, after exposure to a dose of 200 mJ/cm2 UVB and subsequent incubation period of 30 minutes, the maximal activation of p38 was 2.2 ± 0.29. The protective performance of five sunscreen products (SPF between 5 und 50+) was characterized with the established p38-MAPK assay. All the products differed significantly in the amount of activated p38-MAPK compared to the positive control (no protecting product). By means of the SPF only a subdivision of the products into a SPF 5 group and a SPF 16 to 50+ group could be achieved.
The maximal measured increase in p53 protein after exposure to 100 mJ/cm2 UVB and subsequent incubation period of 6 hours was 1.5 ± 0.01. The results of the experiments with sunscreen products were comparable to those found with p38-MAPK. Two sunscreen products with SPF 50+ and 25, as well as the COLIPA Standard P3 (SPF 16) differed hardly from the non-exposed negative control in terms of their p53 protein concentrations. Solely the formulation with pure UVA protection with a low SPF of 5 differed from the other test products. Hence, also with p53 as cell damage marker, merely two groups were achieved: 1) Products with a high, medium and low SPF (SPF 16 to 50+) and 2) Products with a very low SPF (SPF 5).
The only UV-specific marker were the CPD. For the determination of the CPD an ELISA assay as well as a FACS assay could be established. The exposure dose used, was 828 mJ/cm2 with a subsequent incubation period of two hours. Both assays exhibited comparable results, whereby the ELISA, with a maximal detected increase of factor 30 in the CPD amount proved to be more sensitive. The analysis technique FACS produced a maximal increase of factor 8. Eight out of a total of thirteen tested sunscreen products were trade brands and five were development formulations, specifically compounded for these test purposes. The results from the experiments with CPDs as markers allowed a more detailed classification of the products by means of their SPFs. Three groups were compiled with the FACS quantification: 1) Products with high and medium SPF (SPF 25 to 50+), 2) Products with low SPF (SPF 16) and 3) Products with very low SPF (SPF 5). The classification using the ELISA Assay also resulted in three groups: 1) Products with very high and high SPF (SPF 30+ to 50+), 2) Products with medium SPF (SPF 25 and 30) and 3) Products with low and very low SPF (SPF 5 and 16). The experiments with the development formulations, revealed, that under the used test conditions CPDs mainly occur as a result of UVB influence, confirming the predominant opinion in the literature.
An in vitro test system could be established from three of the five potential markers, whereat the CPD quantification was best suitable for classification of the protective performance of sunscreen products. However these DNA dimers are no replacement for SPF, since they are also mainly UVB-specific, nevertheless there is a better known link between DNA damage and the development of cancer compared to erythema.
The determination of the cyclobutane pyrimidine dimers in the developed experimental set-up appears suitable for determining the protective performance of sunscreen products already in an early development phase. Therefore the assay provides an important screening instrument for developers of sunscreen products. ---------- Zusammenfassung: Zusammenfassung: Dem Schutz vor UV-Strahlung und den daraus resultierenden kurz- und/oder langfristigen, schädlichen Einflüssen auf die menschliche Haut, kommt weltweit eine wachsende Bedeutung zu. Steigende Hautkrebsraten zeigen die Dringlichkeit eines umfassenden Schutzes der Haut vor Sonnenstrahlung, sowie einer umfassenden Information und Verhaltensschulung der Bevölkerung auf. Aktuelle Sonnenschutzprodukte enthalten, im Gegensatz zu früheren Formulierungen (zwischen 1985 und 2000), Filterkombinationen, die einen breiteren Schutz im UVB- und UVA-Bereich des Sonnenlichtspektrums aufweisen. Die Wirksamkeit der Produkte wird primär über den Sonnenschutzfaktor (SPF) (in vivo Bestimmung), der ein Mass für den Schutz vor Erythementstehung darstellt, ausgedrückt. Der SPF charakterisiert allerdings nur die UVB-Schutzleistung des Produktes. Die Bestimmung des SPF erfolgt ausschliesslich am Menschen, ist aufwändig, teuer und geht mit einer bewusst in Kauf genommenen Schädigung der Haut der Probanden einher. Hinzu kommt, dass der Zusammenhang zwischen Erythem und Hautkrebsentstehung nicht vollständig geklärt ist. Der UVA-Schutz einer Formulierung kann ebenfalls bestimmt werden und die Erfüllung bestimmter Kriterien wird durch das EU UVA-Logo gekennzeichnet. Der UVA-Schutzfaktor (UVA-PF) kann mit Hilfe einer akzeptierten in vitro Bestimmungsmethode ermittelt werden. Weltweit wird nach weiteren Kenngrössen für die umfassende Charakterisierung der Schutzleistung von Sonnenschutzprodukten gesucht.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines in vitro-Testsystems, das bereits in der Entwicklungsphase von Formulierungen zur Charakterisierung der Schutzleistung eingesetzt werden könnte. Dabei sollen auf zellulärer Ebene Marker evaluiert werden, die sich zur Charakterisierung einer UV-bedingten Schädigung eignen würden. Bei der Auswahl möglicher Zellschadenmarker sollten verschiedene Zelllokalisationen, wie extrazelluläre Matrix, zytoplasmatischer Bereich und Kernregion berücksichtigt werden.
Als mögliche Marker wurden Zytokine (Interleukin 1a und Interleukin 8), die p38-MAPK, p53, sowie Cyclobutan Pyrimidin Dimere (CPD) experimentell untersucht. Als Modell dienten humane normale Keratinozyten (HNK) und immortalisierte HaCaT-Zellen, die einer UV-Bestrahlung ausgesetzt wurden. Zur Analyse der Marker wurden Assay-Techniken wie ELISA und/oder Durchflusszytometrie (FACS) eingesetzt.
Die Kinetiken und Dosis-Effektbeziehungen wurden für jeden Marker in Vorversuchen bestimmt. Zwei der fünf untersuchten Marker lieferten keine reproduzierbaren Ergebnisse. Die Arbeit mit Zytokinen als mögliche Zellschadenmarker erwies sich aufgrund der Messvarianzen als ungeeignet und wurde nicht weiterverfolgt.
Zur Evaluierung der ausgewählten Testsysteme wurden exemplarisch verschiedene Sonnenschutzprodukte (SPF 5 bis 50+) eingesetzt. Die Produkte wurden auf Plexiglasplatten (PMMA-Platten) aufgetragen und diese auf den Kulturbehältnissen der Zellen befestigt. Anschliessend erfolgten die Bestrahlung mit UVB, sowie die Quantifizierung der Marker.
Bei der p38-MAPK fand sich nach einer Bestrahlung mit der Dosis von 200 mJ/cm2 UVB und einer anschliessenden Inkubationszeit von 30 Minuten eine maximale p38-Aktivierung um den Faktor 2.2 ± 0.29. Die Schutzleistung von fünf Sonnenschutzprodukten mit SPF zwischen 5 und 50+ wurde mit dem p38-MAPK-Assay charakterisiert. Alle Produkte unterschieden sich in der Menge an aktivierter p38-MAPK statistisch signifikant von der Positivkontrolle (ohne schützendes Produkt). Anhand des SPFs konnte jedoch nur eine Unterteilung der Produkte in eine Gruppe SPF 5 und eine Gruppe SPF 16 bis 50+ gemacht werden.
Die maximal gemessene Steigerung an p53-Protein betrug nach einer Bestrahlung mit 100 mJ/cm2 UVB und einer darauf folgenden Inkubationszeit von 6 Stunden 1.5 ± 0.01. Die Ergebnisse der Experimente mit Sonnenschutzprodukten waren vergleichbar mit denjenigen mit p38-MAPK als Marker. Zwei Sonnenschutzprodukte mit SPF 50+ und 25, sowie der COLIPA Standard P3 (SPF 16) unterschieden sich in ihren p53-Proteinkonzentrationen kaum von der unbestrahlten Negativkontrolle. Einzig die reine UVA-Schutzformulierung mit einem tiefen SPF von 5 unterschied sich von den anderen Testprodukten. Somit konnten auch bei p53 als Zellschadenmarker lediglich zwei Gruppen ermittelt werden: 1) Produkte mit hohem, mittlerem und tiefem SPF (SPF 16 bis 50+) und 2) Produkte mit sehr tiefem SPF (SPF 5).
Der einzige UV-spezifische Marker waren die CPD. Zur Bestimmung der CPD konnten sowohl ein ELISA-Assay, als auch ein FACS-Assay etabliert werden. Die verwendete Bestrahlungsdosis betrug 828 mJ/cm2 mit einer anschliessenden Inkubationszeit von zwei Stunden. Beide Assays lieferten in ihrer Aussage vergleichbare Resultate, wobei sich der ELISA mit einer maximal detektierten Steigerung der CPD-Menge um Faktor 30 als sensitiver erwies. Die Analysetechnik FACS ergab eine maximale Steigerung um den Faktor 8. Von den dreizehn untersuchten Sonnenschutzprodukten waren acht Handelsprodukte und weitere fünf für diese Testzwecke selbst hergestellte Entwicklungsformulierungen. Die Ergebnisse aus den Experimenten mit CPDs als Marker liessen eine detailliertere Aufteilung der Produkte anhand ihres SPFs zu. Mit der FACS-Quantifizierung konnten drei Gruppen erstellt werden: 1) Produkte mit hohem und mittlerem SPF (SPF 25 bis 50+), 2) Produkte mit tiefem SPF (SPF 16) und 3) Produkte mit sehr tiefem SPF (SPF 5). Die Klassierung anhand der ELISA-Resultate resultierte ebenfalls in drei Gruppen: 1) Produkte mit sehr hohem und hohem SPF (SPF 30+ bis 50+), 2) Produkte mit mittlerem SPF (SPF 25 und 30) und 3) Produkte mit tiefem und sehr tiefem SPF (SPF 5 und 16). Aus den Versuchen mit den Entwicklungsformulierungen konnte zudem die Erkenntnis gewonnen werden, dass CPDs bei den verwendeten Testbedingungen dieser Arbeit hauptsächlich durch UVB-Einfluss entstehen, was die in der Literatur vorherrschende Meinung bestätigte.
Von drei der fünf potentiellen Markern konnte ein in vitro-Testsystem etabliert werden, wobei sich insbesondere das Testsystem der CPD-Quantifizierung als geeignet für eine Klassierung der Schutzleistung von Sonnenschutzprodukten darstellte. Die DNA-Dimere sind in dieser Form zwar kein Ersatz für den SPF, da auch sie vor allem UVB-spezifisch sind, allerdings besteht zwischen DNA-Schädigungen und der Krebsentstehung ein besser bekannter Zusammenhang, als das beim Erythem der Fall ist.
Die Bestimmung der Cyclobutan Pyrimidin Dimere in der entwickelten Testanordnung erscheint geeignet um die Schutzleistung von Sonnenschutzprodukten bereits in der frühen Entwicklungsphase zu bestimmen. Durch diese Möglichkeit wird dem Entwickler von Sonnenschutzprodukten ein wichtiges Screeninginstrument in die Hand gegeben.