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In vitro studies and in vivo evaluation of novel diamidines for 2nd stage sleeping sickness

Wenzler, Tanja. In vitro studies and in vivo evaluation of novel diamidines for 2nd stage sleeping sickness. 2014, PhD Thesis, University of Basel, Faculty of Science.

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Official URL: http://edoc.unibas.ch/diss/DissB_10875

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Abstract

Summary:
African sleeping sickness is one of the most neglected tropical diseases. Transmitted by the tsetse fly it exclusively occurs in sub-Saharan Africa. It is caused by two different parasite subspecies causing two different forms of African sleeping sickness. Trypanosoma brucei gambiense is prevalent in West and Central Africa while Trypanosoma brucei rhodesiense is prevalent in East and South Africa. Sleeping sickness is classified in two main stages. In the first stage, the parasites reside in the lymph and blood system. In the second stage, the parasites additionally infect the brain. Untreated sleeping sickness is fatal. Drugs are available for this fearsome disease, however, most of them are old and have many drawbacks, such as severe adverse effects, treatment failures and complicated treatment schedules, which is a problem in remote rural areas where the disease primarily occurs.
African sleeping sickness is a communicable disease that can be controlled. In 1998, there were an estimated 300,000 cases. By 2012 the prevalence has decreased to about 30,000, by different control measures such as vector control, improved surveillance and free drug distribution. Elimination seems possible, but safe and effective drugs are needed to reach this goal. One of the current drugs is the diamidine pentamidine which is in use since the early 1940s. However, it works only in patients with first stage disease and it has to be injected.
The Consortium for Parasitic Drug Development (CPDD) was founded in the year 2000 to find novel diamidines with better characteristics than the existing drugs. We improved oral absorption, which makes it possible to use pills instead of injections, and central nervous system (CNS) penetration. One compound (pafuramidine) has been tested in patients with first stage infections. It was the first compound that cured sleeping sickness orally, which is of great help for rural areas. Unfortunately, pafuramidine caused kidney and liver problems, and it did not cure second stage infections. In the meantime, we have identified superior compounds especially for the second stage.
As described in Chapter 3, two compounds, the prodrugs DB868 and DB844, given orally, cured all mice with CNS infections. However, both prodrugs were too toxic at the high doses required to cure both stages in monkeys. Nevertheless, DB868 is a good candidate drug to cure first stage sleeping sickness by an oral treatment, as demonstrated in mice and monkeys with first stage infections. Chapter 4 shows data of another CNS potent prodrug, DB1227 which was, however, less effective than DB868 in CNS infected mice.
Chapters 3, 7, 8 and 9 deal with two unmasked diamidines, DB829 and 28DAP010, which were highly effective in mice with second stage infections after i.p. injection. This was unexpected since diamidines are rather unlikely to cross the blood brain barrier in sufficient concentrations by diffusion. These two diamidines may penetrate into the brain by specific transporter proteins. The advantage of the two diamidines is that both cure with a short treatment course which could shorten the time of hospitalization of the patients. We have already tested DB829 in monkeys with promising results. It was safe and effective at low doses and a short treatment schedule in monkeys with second stage disease. 28DAP010 seems to be similarly effective as DB829 on both T. brucei subspecies in vitro and in mouse models.
In Chapter 6 we established a new in vitro method to measure the kinetics of drug action on pathogenic protozoa on a real time basis. We exploited the capacity of viable cells to produce heat and measured the heat flow using microcalorimetry. 28DAP010 inhibited the heat production of trypanosome cultures faster than DB829. The parasite clearance time of 28DAP010 was also faster than of DB829 in mice. The required effective treatment duration was still similar in mice with single dose for first stage and 5 days for second stage infections.
Upcoming efficacy studies will reveal if 28DAP010 is as curative in monkeys as DB829 and toxicity studies of 28DAP010 and DB829 side by side will shed light on their toxicity profile. These studies will help to select the better of these two compounds as a clinical drug candidate for the treatment of second stage sleeping sickness. ---------- Zusammenfassung: Die Afrikanische Schlafkrankheit ist eine Tropenkrankheit, welche durch die Tsetsefliege übertragen wird und daher ausschliesslich im tropischen Afrika vorkommt. Sie gehört zu den vernachlässigsten Krankheiten überhaupt und wird deshalb auch “vergessene Seuche“ genannt. Der Erreger ist ein einzelliger Parasit. Es gibt zwei verschiedene Unterarten, die zu etwas unterschiedlichen Schlafkrankheitsformen führen. Ohne wirksame Medikamentenbehandlung sind beide Formen tödlich. Trypanosoma brucei gambiense kommt nur in West- und Zentralafrika vor, während Trypanosoma brucei rhodesiense in Ost- und Südafrika zu finden ist. Der Krankheitsverlauf kann in zwei Stadien unterteilt werden. Im ersten Stadium findet man die Parasiten im Blut- und Lymphsystem und im zweiten Stadium zusätzlich im Gehirn. Zwar gibt es für diese Krankheit Medikamente, jedoch sind die meisten davon veraltet, haben ausgeprägte Nebenwirkungen und sind wegen Rückfällen oder der komplizierten und aufwendigen Behandlung problematisch.
Die Bekämpfung der Afrikanischen Schlafkrankheit ist möglich. 1998 gab es geschätzt etwa 300.000 Krankheitsfälle. Durch verbesserte Überwachung mit anschliessender medizinischer Behandlung der Infizierten, kostenlose Medikamentenverteilung und Vektorkontrolle, liess sich die Krankheit auf etwa 30.000 Krankheitsfälle im Jahr 2012, eindämmen. Für eine Eliminierung sind wirksame und verträgliche Medikamente notwendig. Ein Diamidin, das schon seit den frühen 40-er Jahren eingesetzt wird ist Pentamidin. Es wirkt noch heute, aber nur in Patienten die sich im ersten Stadium befinden, zudem muss es injiziert werden.
Im Jahr 2000 wurde das Konsortium CPDD, für die Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Behandlung parasitärer Erkrankungen, vor allem für die Schlafkrankheit, gegründet. Neuartige Diamidine mit verbesserten Eigenschaften wurden gesucht und es war uns möglich, die orale Bioverfügbarkeit und die Bluthirnschrankengängigkeit, chemisch zu verbessern. Pafuramidin, war einer der neuen Wirkstoffe, das erste oral einzunehmende Medikament gegen Schlafkrankheit, das im Menschen getestet wurde. Ein orales Medikament hat grosse Vorteile für diese Krankheit, die hauptsächlich in abgelegenen Gebieten Afrikas vorkommt, wo ein ausgebautes Gesundheitssystem oft fehlt.
Pafuramidin heilte nur das erste Schlafkrankheitsstadium und dabei wurden Leber- und Nieren-Unverträglichkeiten festgestellt. Während der klinischen Studie testeten wir weitere Diamidine und fanden verbesserte Substanzen, vor allem bezüglich der Wirksamkeit des zweiten Krankheitsstadiums. Kapitel 3 und 4 beschreibt die wirksamsten Moleküle, die das Zweitstadium bei oraler Verabreichung heilten. Diese Moleküle, DB844, DB868, DB1227, aber auch das Pafuramidin sind Medikamenten-vorstufen (Prodrugs). Diese wurden entwickelt, um die orale Aufnahme und Gehirn-gängigkeit zu verbessern. Die aktivsten waren DB868 und DB844 in Mäusen, jedoch zeigten beide Moleküle toxische Wirkungen im Affen ohne dabei ausreichend die Gehirninfektion zu heilen. Dennoch war DB868 im Affenmodell deutlich besser verträglich als Pafuramidin und ist somit ein guter Ersatzkandidat für eine orale Wirkstoffentwicklung fürs erste Stadium.
Unerwartet konnten wir jedoch zwei Diamidine (ohne Vorstufenergänzung) identifizieren, die ebenfalls Mäuse mit Gehirninfektionen heilten. Da Diamidine unter physiologischen Bedingungen protoniert sind, ist es unwahrscheinlich, dass sie durch die Bluthirnschranke diffundieren. Möglicherweise werden sie über spezifische Mechanismen ins Gehirn transportiert. Kapitel 3, 7, 8 und 9 befassen sich mit den beiden aktivsten Diamidinen, DB829 und 28DAP010. Ihre hohe Wirkung und die kurze Behandlungszeit nach parenteraler Verabreichung (i.p. oder i.m) sind vielversprechend. DB829 war gut verträglich und wirksam bei niedrigen Dosen und heilte die infizierten Affen mit dem zweiten Krankheitsstadium bereits bei einer 5-tägigen Behandlung. In vitro und im Mausmodel war 28DAP010 auf beide Trypanosomen Unterarten ähnlich wirksam wie DB829.
Um die Wirkungszeit neuer Substanzen auf Trypanosomen zu testen, entwickelten wir eine neue Methode, die in Kapitel 6 beschrieben wird. Dabei nutzten wir die Eigenschaft der Zellen, Wärme zu produzieren und massen diese mit einem Kalorimeter auf Echtzeit. 28DAP010 reduzierte die Wärmeentwicklung einer Trypanosomenkultur deutlich schneller als DB829. Auch in infizierten Mäusen wirkte 28DAP010 schneller. Die Behandlungsdauer und Dosierung war bei beiden Diamidinen trotzdem vergleichbar. Eine Einzeldosis heilte das erste und eine 5-tägige Behandlung das zweite Stadium in Mäusen.
Weitere Studien sind nötig, um die Wirksamkeit von 28DAP010 im Affenmodel zu überprüfen und die Verträglichkeit beider Diamidine zu analysieren. Diese Ergebnisse werden zeigen, welches der bessere klinische Kandidat für die Behandlung des zweiten Schlafkrankheitsstadiums sein wird.
Advisors:Brun, Reto
Committee Members:Croft, Simon
Faculties and Departments:09 Associated Institutions > Swiss Tropical and Public Health Institute (Swiss TPH) > Former Units within Swiss TPH
Item Type:Thesis
Thesis no:10875
Bibsysno:Link to catalogue
Number of Pages:138 S.
Language:English
Identification Number:
Last Modified:30 Jun 2016 10:56
Deposited On:04 Sep 2014 10:09

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