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Structural investigation on membrane proteins : the case of the KdgM porin family, OmpF and IIBCSUC

Wirth, Christophe. Structural investigation on membrane proteins : the case of the KdgM porin family, OmpF and IIBCSUC. 2012, PhD Thesis, University of Basel, Faculty of Science.

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Official URL: http://edoc.unibas.ch/diss/DissB_9783

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Abstract

Gram-negative bacteria are surrounded by two distinct membranes delimiting the periplasm. The inner-membrane (or cytoplasmic membrane) is composed of a phospholipid bilayer whereas the outer-membrane is asymmetric and composed of lipopolysaccharides in the outer leaflet and phospholipids in the inner leaflet. Both membranes are spanned by numerous membrane proteins. These are various and their genes are representing about 30% of the genome in living organisms. Although the first membrane protein structures were solved in the 80s using X-ray crystallography, structural data is still very limited. This dissertation groups our contributions to this field in the last few years and is divided in three parts.
A first chapter will describe our work on the structural characterization of proteins from the KdgM family. This family of small porins has been first identified in Dickeya dadantii a plant pathogen. It has been shown that members of that specific porin family are able to transport acidic (oligo)saccharides but the structural and biochemical data remain scarce. We undertook to study this family using X-ray crystallography working in parallel on several homologues. The chapter is divided in three parts: (I) the purification of the Escherichia coli NanC porin, a member of the KdgM family involved in the uptake of sialic acid, its crystallization and structure determination at 1.8 Å resolution; (II) the discussions concerning the biological implications of the NanC structure that was published in a research article as well as additional discussions, and (III) the still ongoing work on the purification and crystallization of KdgM using microseeding matrix screening and surface entropy reduction.
In a second chapter, we will discuss a new crystal form of OmpF, the general porin of E. coli. OmpF is probably the best studied outer-membrane general porin as it is very abundant and rather easy to purify. It has also been used as a model to study translocation of ions through porins. Since it first structural determination, OmpF structures have been determined in several space groups. Here we report a new crystal form diffracting to 2.7 Å resolution and we discuss the presence of 32-symmetry related, honeycomb like layers reoccurring in almost all OmpF crystal forms and formed by identical contacts.
The last chapter will discuss the purification and crystallization attempts of the inner-membrane sucrose specific permease IIBCsuc from Salmonella typhimurium and of its complex with a Fab antibody fragment. This protein belongs to the phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system (PTS) which is ubiquitous in eubacteria, but is not found in other organisms. The PTS belongs to the group translocation super-family of transporters and is composed of proteins or domains allowing the specific uptake of a sugar and its concomitant phosphorylation. Apart from topology studies, no structural data is available on the sugar translocation proteins of the PTS whereas all other members have been characterized. In order to increase the crystallization ability of the IIBCsuc permease, we used monoclonal antibodies Fab fragments to enlarge the hydrophilic surface of the permease and to rigidify its structure. Fab fragment production, purification and binding will be discussed as well as crystallization trials of IIBCsuc-Fab complexes. ---------- Zusammenfassung
Komplex Herstellung. Zwei neue Ligandenklassen wurden hergestellt und in der Iridium-katalysierten asymmetrischen Hydrierung getestet. Ausgehend von R,R- und S,S-Diphenylethylendiamin verbunden mit verschiedenen chiralen Pyridinylalkoholen wurden zwölf verschiedene Diazaphospholidin-Liganden hergestellt und zu Iridium-Komplexen umgesetzt. Diese Komplexe wurden in der Hydrierung von verschiedenen unfunktionalisierten und funktionalisierten Alkenen, besonders aber für alpha, beta-ungesättigte Carbonsäureester, getestet. Die Hydrierungen der verschiedenen Alkene waren sehr erfolgreich, sie lieferten Enantiomerenüberschüsse von bis zu 99%. Bei alpha-methylierten alpha, beta-ungesättigten Carbonsäureestern mit verschiedenen Substituenten in der beta-Position ergaben die Hydrierungen über 90% ee. Für die beta-methylierten Carbonsäureester lieferten die neuen Iridium-Komplexe bis zu 97% ee.
Die Entwicklung und Herstellung von neuen P,N-Liganden, welche auf Imidazolinen basieren, wurde als nächstes untersucht. Strukturell ähnliche Oxazolin-Liganden wurden durch Imidazoline ersetzt. Durch das zusätzliche Stickstoffatom kännen die elektronischen und sterischen Eigenschaften der Liganden modifiziert werden. Eine erfolgreiche Syntheseroute zur Herstellung der Imidazolin-Iridium-Komplexe wurde entwickelt. Allerdings waren die Hydrierungen mit den neuen Imidazolin-Iridium-Komplexen eher unbefriedigend.
Eine Verbesserung der Imidazolin-Liganden gelang, indem man den aromatischen Ring am Stickstoffatom durch eine Sulfonyl-Gruppe ersetzte. Es wurde eine neue Syntheseroute für diese Ligandenklasse entwickelt und es konnten somit vier neue Sulfonyl-Imidazolin-Iridium-Komplexe hergestellt und in der asymmetrischen Hydrierung getestet werden. Die Hydrierungen von verschiedenen unfunktionalisierten und funktionalisierten Alkenen lieferten Enantiomerenüberschüsse von über 90%.
Anwendung in Naturstoff- und Wirkstoffsynthesen. Der zweite Teil dieser Arbeit war die Anwendung der Iridium-katalysierten asymmetrischen Hydrierung zur Herstellung von biologisch wichtigen Naturstoffen. Bei einer Zusammenarbeit mit Prof. J. Mulzer (Universität Wien, …sterreich) wurde eine asymmetrische Synthese für Platensimycin entwickelt. Die geplante Syntheseroute beinhaltete die asymmetrische Hydrierungen von zwei Zwischenstufen, welche erfolgreich mit exzellenten Umsätzen und Enantioselektivitäten erreicht wurden. Dabei lieferte der Iridium-Komplex 67c die besten Ergebnisse. Die Zwischenstufe konnte mit einer geringen Katalysatorbeladung und im Gramm-Ma§stab umgesetzt werden.
Das nächste Projekt war die Synthese von Aliskiren. Dabei wurden verschiedene Ester hergestellt und in der Iridium-katalysierten asymmetrischen Hydrierung getestet. Nach einer ausgiebigen Suche für einen geeigneten Katalysator lieferte der PHOX-Komplex 28a und der PHIM-Komplex 134a für den tert-Butylester vollständigen Umsatz und 99% ee.
Advisors:Schirmer, Tilman
Committee Members:Erni, Bernhard
Faculties and Departments:05 Faculty of Science > Departement Biozentrum > Structural Biology & Biophysics > Structural Biology (Schirmer)
Item Type:Thesis
Thesis no:9783
Bibsysno:Link to catalogue
Number of Pages:177 S.
Language:English
Identification Number:
Last Modified:30 Jun 2016 10:42
Deposited On:21 Mar 2012 14:21

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